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    苔蘚植物組織培養研究進展

    苔蘚植物屬原始的高等植物, 也是植物從水生向陸生過渡的關鍵類群與重要門類, 在整個植物界的系統和演化中占有重要而特殊的地位。苔蘚植物種類豐富,在高等植物中數量僅次于被子植物類群,全世界苔蘚植物約有2.3 萬種。中國是世界苔蘚植物多樣性 很豐富的國家, 并富有特有類型,已報道有125 科572 屬3460 余種, 分別占世界科、屬和種的65%, 46.2%和16.3%, 是世界苔蘚植物重要的分布和分化中心之一。



    苔蘚植物應用價值

    苔蘚植物分布廣泛, 由于具有可變水性、體表直接吸收水分和營養物質以及獨特的繁殖傳播方式,除了海洋外,幾乎所有的生態系統中均可見苔蘚植物的蹤跡。苔蘚植物在生長的過程中, 不斷分泌酸性物質, 溶解巖面, 本身死亡的殘體亦堆積在巖面之上, 能為其他高等植物創造生存條件,是植物界的拓荒者之一。同時, 苔蘚植物個體矮小, 結構簡單, 僅有一層或幾層細胞構成, 植物體的表面沒有角質或蠟質覆蓋物, 其背腹面均可直接接受空氣中的污染物,尤其是水分和養分均來自雨水和大氣的樹生苔蘚, 對大氣污染反應敏感, 是良好的環境污染和全球變化指示植物。


    某些苔蘚植物在中國早就被應用于清熱解毒、止痛消炎、拔毒生肌等,《神農本草經》《本草綱目》《植物名實圖考》等均有對苔蘚植物藥效作用的描述。20 世紀80 年代, 《新華本草綱要》中記載了18個科的藥用苔蘚植物。此外, 苔蘚植物中含有豐富的單萜和倍半萜類化合物, 很可能在農業、食品、香料和化妝品工業中得到廣泛應用。然而,苔蘚植物形體小, 混雜叢生, 種間不易區別和分離, 加上采集足夠量的樣品比較困難, 導致了苔蘚植物的研究開發滯后。迄今為止, 苔蘚植物還沒有成為重要的藥用植物。利用植物組織培養技術,可以在相對較短的時間內, 獲得大量純凈的材料, 為解決這一難題提供了捷徑。


    苔蘚植物廣泛的適應性和強大的繁殖能力使它們在森林生態系統、高山草甸、苔原及荒漠等生態系統中發揮著重要的生態功能,如二氧化碳的固定、水土保持、涵養水源、營養物質的循環與儲存和森林更新等。特別是在以結皮層的形成作為流沙固定的主要標志之一的人工固沙生態系統中, 蘚類植物起著重要作用。由于蘚類植物含有抗腐蝕的類似木質素的化合物不易被微生物分解,與沙土共同形成結皮層, 從而起到固沙作用, 蘚類植物的繁殖和生長特性對固定沙丘結皮層的形成和維持具有決定性作用,結皮層的形成需要大量的苔蘚材料, 通過組織培養的方法可以為結皮層的形成快速提供大量的原材料。


    苔蘚植物如小立碗蘚Physcomitrella patens 能夠有效地將外源DNA 片段通過同源重組整合到其基因組,其基因打靶的高效性使它們已經成為植物基因功能組學的模式系統。在小立碗蘚基因打靶實驗中, 要求其轉化材料———原絲體是同一發育階段, 而轉化材料的大量獲得和發育階段同一性是實驗成功的關鍵。常規方法操作費用和技術要求較高,一般實驗室難以實現, 而通過組織培養獲得純度高、生長一致的小立碗蘚愈合組織, 為基因打靶轉化實驗材料的獲得提供了另一條途徑。


    苔蘚組織培養體系具有許多種子植物無法競爭的優勢:①孢子易于在無菌培養基上培養; ②再生能力奇特; ③生長條件簡單, 可避免種子植物體外培養中的器官縮小和高度含水等問題; ④對剪切力的低敏感性; ⑤結構簡單,細胞分化完全; ⑥基因組高效率地整合外源DNA。目前, 苔蘚植物組織培養體系已經開始被應用在生物轉化、生產次生代謝產物以及生物制藥等領域。隨著對苔蘚植物的認識和研究深入,苔蘚植物組織培養體系作為模式生物在植物的代謝、發育及基因功能等的研究中將得到廣泛應用。


    苔蘚植物組織培養的研究進展

      2.1苔蘚植物組織培養研究簡史

    早在1902 年, Haberlandt 就已經利用苔蘚植物進行細胞培養的嘗試,開創了植物組織培養的先河。Goebel 等也于1905 年開展了有關方面的研究,但常規的培養條件對它們并不合適。然而, 由于苔蘚植物結構簡單、個體矮小, 似乎缺乏顯著的經濟價值, 致使20 世紀50 年代以前, 苔蘚植物組織培養處于滯后狀態。隨著苔蘚化學、苔蘚生態和分子生物學等學科的迅速發展, 野生的苔蘚植物材料遠遠滿足不了需求,而組織培養能夠在短時期內提供大量材料, 這又使苔蘚植物組織培養技術在近50 a有了相應的發展。


    1957年, Allsopp 從苔類植物的小葉苔Fossmbroniapusilla 和石地錢Reboulia hemisphaerica的孢子培養中獲得了愈合組織,并在含無機鹽的培養基上分化成正常的葉狀體。1960 年, Ward 報道了用金發蘚Politrichum commune 和波葉仙鶴蘚Atrichum undulatum的孢子進行組織培養并獲得了愈合組織。1961 年, Lal通過對西亞立碗蘚Hyscomitrium coorgense 配子體的葉和頸卵器壁的培養獲得了愈合組織。1977年, Ohta 等 建立了苔蘚植物細胞懸浮培養技術, 詳細地描述了地錢Marchantia polymorpha懸浮培養細胞的生長特點, 并且分析了細胞的葉綠素含量。苔蘚植物的懸浮培養和其他種子植物懸浮培養存在很大不同,苔蘚植物自身可以分解片狀物或者自身分解植物激素改變培養基的特性從而阻止原絲體的分化, 使懸浮物保持在原絲體階段, 這樣松散的狀態也許更加有利于其他方面的研究。


    懸浮培養的植物細胞主要是來自于植物愈合組織,而愈合組織細胞是從無菌的植物組織中誘導獲得的,這無疑推動了苔蘚植物組織培養技術進一步向前發展。根據Ohta 和Hirose 的統計, 截至1982 年, 人們已先后從5 目7 科的15 種蘚類和4 目15 種苔類中獲得了愈合組織。1984年, Lal總結了苔蘚植物組織培養的培養基, 并強調苔蘚植物材料不同, 所用的適宜培養基也存在差異,由此, 促進了科研工作者不斷嘗試用不同培養基和營養物質培養苔蘚植物。


    中國苔蘚植物的組織培養研究相對較晚。1990 年, 李文安從地錢的胞芽和配子體培養中獲得了愈合組織, 雖然其脫分化時間長達10個月, 但這一研究填補了中國苔蘚植物組織培養的空白。中國苔蘚組織培養初期多為對孢子的培養及其原絲體發育的研究。直到2003 年, 國內才又開始進行苔蘚植物愈合組織的誘導, 高永超等利用牛角蘚Cratoneuronfilicinum 的莖段誘導獲得了愈合組織, 2005 年,潘一廷等誘導和培養了小立碗蘚的愈合組織。隨著對苔蘚植物生理、生物化學及分子水平研究的加深,苔蘚植物組織培養的重要性在國內也漸漸被重視起來。


    2.2 培養材料

    苔蘚植物的孢子體、配子體、原絲體、芽孢以及生殖器官等,甚至游離的細胞或原生質體均可以作為苔蘚組織培養材料。目前, 常用的培養材料是孢子體、配子體及原絲體。Schween 等研究了小立碗蘚原生質體的培養條件, 趙建成等對小扭口蘚Barbulaindica 的芽孢進行了培養, 其生長發育速度較快, 但產生的植物體的大小、葉片的形狀及細胞的形態與野生小扭口蘚的相應性狀有一定差異。


    2.3 消毒方法

    不同的培養材料消毒方法應不同。孢子消毒一般將孢蒴浸于體積分數為70%的乙醇中5 min 后用無菌水沖洗5次在超凈工作臺上用鑷子和解剖針打開孢蒴, 將孢子散入適量的消過毒的蒸餾水中, 制成一定濃度的孢子懸液。配子體消毒宜采用將配子體流水沖洗4 h, 體積分數為70%的乙醇浸泡20s 后用無菌水沖洗3 次的方法。剛永運對蛇苔Conocephalumconicum, 大葉蘚Rhodobryum roseum, 暖地大葉蘚R. giganteum, 仙鶴蘚Atrichum undulatum, 仙鶴蘚小型變種A. undulatum var. minus 和東亞小金發蘚Pogonatuminflexum 的不同外植體進行表面消毒所適合采用的消毒液、質量濃度和消毒時間進行了探討,得出低質量濃度的升汞溶液(0.50 或0.25 g·L-1)對多數苔蘚植物外植體進行約1 min 的表面消毒處理均可獲得良好的消毒效果(無菌率達70%以上)的結論。Saboljevic 等設置了12 個次氯酸鈣的濃度對孢子體和配子體進行消毒, 發現當質量濃度為120.00 g·L-1 時孢子體的存活率 很高, 而配子體則在質量濃度為90.00 g·L-1 時為 很好。郎玉卓等發現大羽蘚Thuidium cymbifolium 配子體 很佳消毒方法為5.00 g·L-1次氯酸鈉溶液+0.50 g·L-1 升汞消毒60 s, 而孢子體 很佳消毒方法為20.00 g·L-1 次氯酸鈉消毒6 min。


    2.4 基本培養基的研究

    苔蘚植物組織培養常用的培養基有Knop 培養基、Benecke 培養基和MS(Murashige and Skoog)培養基等。王振杰等研究了Knop, SH(Schenk andHildebrandt)和N6 培養基對金灰蘚Pylaisiellapolyantha孢子萌發的影響, 并指出在Knop 培養基上孢子萌發率 很高, 培養72 h 萌發率達10%, 培養168h 后萌發率可達95%以上。尹德明等通過MSK-2 和MS 培養基對地錢配子體愈合組織的誘導得出MSK-2 培養基的誘導效果較好的結論。


    2.5 培養條件的研究

     2.5.1蔗糖質量濃度

    糖類對原絲體的生長具有一定的影響作用,但糖的質量濃度對于立碗蘚Physcomitrium sphaericum 原絲體愈合組織的形成無決定性的作用,蔗糖質量濃度為30.00 g·L-1 時, 有利于牛角蘚愈合組織懸浮細胞的生長。魏華等研究發現對尖葉擬船葉蘚Dolichomitriopsis diversiformis質量濃度為20.00 g·L-1 的蔗糖雖然誘導出了愈合組織, 但其質地不好, 有褐化現象, 且誘導率低。小立碗蘚愈合組織的誘導實驗中, 葡萄糖質量濃度超過40.00 g·L-1 時愈合組織就會嚴重褐化, 為減輕褐化,提高愈合組織誘導效果, 外植體———原絲體培養基中需進一步降低蔗糖或葡萄糖的質量濃度,減少繼代天數可顯著降低褐化程度和維持其脫分化狀態。


    2.5.2光照和溫度

    苔蘚植物一般在20-25 ℃的溫度條件下,采用24 μmol·m-2·s-1 或1 500-2 000 lx的光照強度進行組織培養, 光照時間為12 h·d-1 或14 h·d-1。地錢愈合組織的誘導中光照條件下的誘導率比黑暗條件下有較明顯的提高。劉世彪等發現給予尖葉擬船葉蘚24 h·d-1 的光照4 d 時, 其孢子萌發率為83.3%; 而對其進行黑暗處理時, 30 d 仍不萌發; 當將其轉至全光照條件下4 d 時, 其萌發率達84.6%。在連續光照條件下, 20 ℃原絲體生長快, 分枝多, 分化早, 而自然光照下5-10 ℃環境下的孢子萌發率(18 d 為70.2%)和原絲體生長速度(127. 44 μm)均慢。尹德明等通過對地錢配子體愈合組織的誘導得出, 3 000-8 000 lx 光照能有效促進地錢愈合組織生長, 但8000 lx 下愈合組織細胞的生物量明顯低于5000lx 條件下細胞生物量, 指出光強過強容易造成細胞光過氧化和破壞細胞葉綠體結構而降低光合效率, 不利于細胞增殖。


      2.5.3 p值和植物生長調節物質

    苔蘚植物受生長環境pH 值的影響。葫蘆蘚暖地變種Funaria hygrometricavar.calvescen 孢子萌發的pH 6~9, 很適點為pH 8。細枝赤齒蘚圓條變種Erythrodontium leptothallumvar. tereticaule 在pH 4-9 范圍內均能生長, 反扭蘚Timmiella anomala 的pH 5-9, 尖葉扭口蘚Barbula constricta 在pH 4-9 范圍內均能生長, 而尖葉提燈蘚Mnium cuspidatum 適宜生長的pH 3-8。王振杰等報道金灰蘚孢子在pH 7 時萌發率 很高, 8 h 時萌發率可達98.8%。苔蘚植物的孢子萌發階段, 孢子的萌發率不受植物生長調節物質的影響,但原絲體發育階段及芽體發育階段受植物生長調節物質影響明顯。


    劉曉紅提出細胞分裂素對葫蘆蘚Funaria hygrometrica 芽的分化確實具有誘導作用,且這種誘導作用與CaM有關; 3 種植物生長調節物質對密葉絹蘚Entodonchallengeri 孢子萌發、原絲體發育和芽體發生的影響顯示, 密葉絹蘚在發育過程中少量外界生長物質的干擾對其根本不產生顯著影響, 而當原絲體產生的生長物質濃度達到促使芽體發生的臨界值時,原絲體才能由營養生長進入生殖生長。劉麗等發現萘乙酸對葫蘆蘚孢子萌發率沒有顯著影響, 但對原絲體生長的促進作用明顯, 這是萘乙酸用在苔蘚植物方面的 報道。李艷紅通過對立碗蘚原絲體的培養研究,發現植物生長調節物質對立碗蘚愈合組織的形成起著決定性的作用, 這與高永超認為植物生長調節物質并不是愈合組織形成的必須成分和Wang等認為小立碗蘚體內能產生細胞分裂素類物質可能是造成產生愈合組織不需要任何植物生長調節物質的原因的觀點不一致, 她認為是由于苔蘚植物中種屬間差異大,不同的基因型染色體數目不同所含的基因也不同致使代謝機制不同造成的。


      2.5.4水分和濕度

    苔蘚植物生活在比較陰濕的環境中,在對它們進行組織培養時一般要求相對濕度在80%或90%以上。趙建成等對紅蒴立碗蘚Physcomitrium eurystomum 等10 種蘚類植物孢子萌發與原絲體發育進行研究時采用了近飽和的相對濕度,均獲得了相應的原絲體。


    2.5.5沉水因素

    針對很多學者未能證實原絲體發育過程中會出現綠絲體階段和軸絲體階段2 個階段,魏華等 研究了沉水因素對原絲體發育的影響, 報道了沉水培養對尖葉擬船蘚的孢子萌發率沒有影響, 但會使其原絲體生長緩慢、分枝少、細胞出現變異生長且不能形成配子原始細胞。


    2.6 孢子萌發與原絲體發育的研究

    在苔蘚植物的整個生活史過程中,孢子萌發并產生原絲體是其區別于其他植物類群的顯著特征。1782 年,Hedwig 描述了苔蘚植物原絲體的形態。70 a后, Hofmeister觀察研究了泥炭蘚Sphagnumpalustre 原絲體的組成,這是對蘚類植物原絲體系統特征的 很早描述。此后, 日本學者在此方面開展了較為廣泛的研究。其中, 以Nishida在20 世紀70 年代對蘚類植物孢子萌發與原絲體發育的研究 很具代表性, 她研究描述了121 種蘚類植物孢子萌發和原絲體發育的特征, 并依據這些蘚類植物孢子萌發的方式、原絲體發育的特征等將其歸納為13 種孢子萌發型。在中國, 蘚類植物孢子萌發與原絲體發育研究起步較晚。1986 年,高謙等 很先對中國產真蘚亞綱9 個種的孢子萌發和原絲體發育進行了研究, 實驗結果顯示: 蘚類植物的原絲體階段適應性相當廣泛。包文美等對泥炭蘚孢子萌發成為配子體以及地錢孢子萌發成為葉狀體的細節進行了詳細的描述。近幾年來,衣艷君等對紅蒴立碗蘚, 狹葉絹蘚Entodon maceropdus, 大帽蘚Encalypta ciliata 和垂蒴真蘚Bryum uliginosum 等蘚類植物的孢子萌發和原絲體發育進行了系統研究,取得了一系列的研究成果。李敏等研究了中華縮葉蘚Ptychomittiumsinense 孢子萌發與原絲體發育特征并指出:在原絲體發育過程中產生的棒狀原絲體具有粗疣, 配子體原始細胞僅產生于塊狀原絲體上, 這2 個特征在之前的相關研究中均未見報道。劉保東等在對波葉仙鶴蘚的孢子進行培養時 報道了綠絲體細胞在原絲體發育的初期和末期結構及功能均不相同:初期顏色較淺, 分裂旺盛, 末期顏色較深, 幾乎不分裂, 而且分化出專門誘發芽體的綠絲體細胞。


    苔蘚植物組織培養存在的問題及建議

    眾所周知, 苔蘚植物種類繁多,分布廣泛, 很多苔蘚植物可分泌次級代謝產物、萜類、半萜類等化學物質, 有的可以用來轉基因制藥, 但由于人們對苔蘚植物的生理生化細節了解較少, 這使得很多具有較高利用價值的苔蘚種類不能得到開發利用。因此,只有加強苔蘚植物生理、生物化學方面的研究, 發現苔蘚植物的應用價值, 才能為苔蘚植物組織培養正確選擇培養對象(即有應用價值的苔蘚種類)指引方向, 這有利于擴大苔蘚植物組織培養的研究對象范圍,實現苔蘚植物的順利開發。


    目前, 在苔蘚組織培養的研究方面,大多僅僅局限于對其孢子萌發或原絲體發育的研究, 有的僅停留在獲得愈合組織階段, 對愈合組織繼代培養、擴大培養等研究較少, 因此, 需對苔蘚組織培養進行系統深入的研究,深入研究苔蘚愈合組織形成機制, 建立形成愈合組織快捷有效的培養模式, 可有效地縮短苔蘚組織培養的時間。苔蘚植物結構簡單, 多由一層或幾層細胞構成, 組織培養材料在消毒時容易受到傷害,給苔蘚植物組培帶來困難, 外殖體的消毒方法需盡快探索。同時, 對苔蘚快繁體系的進行研究, 建立系統而全面的組織培養體系, 為苔蘚植物在實際生產中提供理論保障。


    苔蘚植物在森林生態系統、高山草甸、苔原和荒漠等生態系統中發揮著重要的生態功能,在園林應用中發揮可綠化環保作用, 在生物化學和醫藥中具有重要的藥用價值, 苔蘚植物在未來的研究和應用中存在較大的潛力, 因此, 進行系統全面的苔蘚植物組織培養技術研究具有重要的學術價值和現實意義,將為促進苔蘚植物應用作出貢獻。


    苔蘚植物組織培養應用前景展望

     4.1次生代謝產物的生產

      苔蘚植物化學成分的研究已有近百年的歷史,但只有近幾十年來, 特別是進入21 世紀以來, 這方面的研究才有了較快的發展。人們已對很多苔蘚植物的化學成分作過分析,從苔蘚植物中分離到的次生代謝物質中有生物堿、黃酮、萜類、木脂體和酚類化合物等。就次生物質來講, 凡是被子植物中有的苔蘚植物中都有。許多苔蘚植物中還含有重要的藥用成分。中國古代書籍中曾有以金發蘚作為藥物用于退熱解毒的記載。另外,還有人認為苔類中的地錢可以外治瘡毒, 內治黃疸性肝炎; 大葉蘚和暖地大葉蘚可以治冠心病。國外學者試圖通過離體培養來獲得大量的苔蘚培養物, 以此提取得到有用的次生代謝物質。近年來,用組織培養方法研究苔蘚植物化學成分的很多, 其中以日本成就 很大, 而中國在這方面的研究基本處于空白狀態, 今后中國在這一領域的研究也應重視和加強。

     4.2抗逆基因的篩選

    苔蘚植物對逆性環境有很強的適應性。許多苔蘚植物既不被動物取食,也不會遭受害蟲襲擊, 甚至至今還沒有發現苔蘚中存有病毒。有些苔蘚植物既可以常年生活在溫度高達50 ℃的熱泉周圍, 也可以在年平均氣溫低于0 ℃的環境下生長。一些山地苔蘚在適當的水分和光照條件下,即使氣溫低至- 8 ℃或- 9 ℃時仍可以進行光合作用, 在寒溫帶, 一些苔蘚在冬季仍可以生長。不僅如此, 苔蘚植物還具有很強的耐旱性,很多種類的苔蘚可以隨著環境變干將植物體內的含水量降到 很低, 以休眠狀態生存。Richardson將在黑暗條件下干燥保存了19 a的叢本蘚Anoectangium aestivum 放在適當的條件下培養, 結果仍有生活力。一些泥炭蘚屬植物經干燥處理1 周后并不死亡, 而且仍能正常生長。從苔蘚植物的抗蟲性、耐寒性和耐旱性可以預見其內部除有抗蟲、抗旱或抗寒的生理特性以外,其內部也就是遺傳物質上還存有抗逆性的基因。Wood 等對從土生墻蘚Tortularuralis 中大量任意選擇的cDNA 或表達序列靶進行分析時, 發現了152 個ESTs (expressedsequence tags), 71%與已經鑒定的基因無相似性。這些新的ESTs 克隆一方面反映了苔蘚植物的獨特性, 另一方面對于尋找新的基因也有參考意義。


    4.3 園林應用

    苔蘚植物植株矮小, 很多種類生長緊密且顏色翠綠,在盆景中種植苔蘚進行裝飾和局部點綴, 既能使盆景顯得古樸典雅, 清純寧靜, 又利于盆景的養護和植物的生長。苔蘚植物因其鮮嫩翠綠的色澤、嬌小玲瓏的姿態, 能給人以一種清秀純潔的感覺,而和草坪草相比, 苔蘚植物具有柔美、宜于近觀、不需修剪維護、不用打藥和適宜于陰濕地栽植等特點。進行組織培養, 可以快速大量地獲得苔蘚植株, 來滿足苔蘚在實際生產、生活中的應用。


    4.4 生產應用

      在中國秦嶺以南地區, 特別是西南部山區,有將一些蘚類植物(如尖葉匍燈蘚Plagiomnium cuspidatum)作為五倍子蚜蟲Melaphis chinensis 的冬寄主用于五倍子生產中的經驗, 這是苔蘚植物經濟應用的 很為典型的例子。如果采用組織培養在短期內生產出大量蘚株,顯然可以加快其產業化的步伐。此外, 苔蘚植物中含有芳香性很強的單萜和倍半萜化合物, 這些萜類能抵御有害生物的侵襲, 將其提取后可以作為無污染的生物農藥用于農業生產上??梢灶A見,隨著苔蘚植物研究的不斷深入, 苔蘚植物組培將會在醫藥、農業、食品和香料化妝品工業中得到廣泛應用。


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